cours de LA CYTOMETRIE EN FLUX
INTRODUCTION
Qu'est ce que la Cytométrie en flux?
C'est une technologie qui permet la mesure simultanée de plusieurs caractéristiques physiques d'une particule (cellule) en suspension.
Quelles sont les informations sur la cellule apportées par la cytométrie en flux (CMF)?
Sa taille relative (Forward Scatter),
Sa granularité ou sa complexité interne relative (Side Scatter),
Son intensité relative de fluorescence.
C'est une technologie qui permet la mesure simultanée de plusieurs caractéristiques physiques d'une particule (cellule) en suspension.
Quelles sont les informations sur la cellule apportées par la cytométrie en flux (CMF)?
Sa taille relative (Forward Scatter),
Sa granularité ou sa complexité interne relative (Side Scatter),
Son intensité relative de fluorescence.
HISTORIQUE
Les méthodes d’analyse des cellules individuelles sont essentielles pour la compréhension des fonctions des cellules normales et la possibilité de modulation des cellules pathologiques. La cytométrie en flux (CMF) est née du besoin d’automatisation du comptage des constituants cellulaires du sang.
Les origines de la CMF sont anciennes puisque c’est en 1934 que Moldavan conçut le premier appareil avec lequel il réalisait des numérations cellulaires en faisant défiler les cellules dans un fin capillaire où elles étaient vues par un capteur photo électrique. Dans les années 70, les chercheurs de Los Alamos et de Stanford associaient des méthodes de mesure individuelle du volume ou de la fluorescence de cellules entraînées par un flux avec des méthodes électrostatiques permettant le tri cellulaire dans des conditions vitales. La diffusion de la lumière compléta rapidement la liste des propriétés capables de discriminer plusieurs types cellulaires. Le développement simultané d’appareillages commercialisés polyvalents et l’apparition des hybridomes pour la production d’anticorps monoclonaux a conduit à une explosion des activités impliquant la cytométrie en flux. L’utilisation des propriétés cellulaires intrinsèques (diffusion, auto fluorescence) et le développement permanent de fluorochromes capables de traduire de nombreuses propriétés et fonctions cellulaires ont conduit à la mise en oeuvre de méthodes de plus en plus fines pour l’analyse de populations de cellules hétérogènes.
Les origines de la CMF sont anciennes puisque c’est en 1934 que Moldavan conçut le premier appareil avec lequel il réalisait des numérations cellulaires en faisant défiler les cellules dans un fin capillaire où elles étaient vues par un capteur photo électrique. Dans les années 70, les chercheurs de Los Alamos et de Stanford associaient des méthodes de mesure individuelle du volume ou de la fluorescence de cellules entraînées par un flux avec des méthodes électrostatiques permettant le tri cellulaire dans des conditions vitales. La diffusion de la lumière compléta rapidement la liste des propriétés capables de discriminer plusieurs types cellulaires. Le développement simultané d’appareillages commercialisés polyvalents et l’apparition des hybridomes pour la production d’anticorps monoclonaux a conduit à une explosion des activités impliquant la cytométrie en flux. L’utilisation des propriétés cellulaires intrinsèques (diffusion, auto fluorescence) et le développement permanent de fluorochromes capables de traduire de nombreuses propriétés et fonctions cellulaires ont conduit à la mise en oeuvre de méthodes de plus en plus fines pour l’analyse de populations de cellules hétérogènes.
DEFINITIONS
La CMF est définie comme l’étude précise de cellules isolées entraînées par un flux liquide. C’est une technique de caractérisation individuelle, quantitative et qualitative de particules en suspension dans un liquide.
Elle consiste à analyser les signaux optiques ou physiques émis par une particule coupant le faisceau lumineux d’un laser ou d’une lampe à arc. Les signaux mesurés sont essentiellement relatifs:
-aux propriétés optiques intrinsèques des particules qui correspondent aux phénomènes de diffusion lumineuse liés aux dimensions de la particule, à leur structure interne, ou à l’auto fluorescence de certaines cellules comme les végétaux, le phytoplancton...
-aux propriétés optiques induites de fluorescence obtenues par des marquages spécifiques de structures ou de fonctions cellulaires.
Ces signaux séparés par des filtres optiques sont collectés par des photomultiplicateurs, amplifiés, numérisés, traités et stockés par un ordinateur.
Ce procédé d’analyse individuelle (cellule par cellule) est multiparamètrique et peut s’effectuer à la vitesse de plusieurs milliers d’événements par seconde. L’ordinateur calcule les données statistiques associées aux distributions des paramètres mesuré et les représente sous la forme d’histogrammes (1 paramètre) ou de cytogrammes (2 paramètres) sur une ou plusieurs populations dont les propriétés cellulaires sont ainsi évaluées.
La fonction tri des cytomètres en flux les plus évolués permet de trier physiquement plusieurs populations cellulaires définies par leurs propriétés optiques.
-aux propriétés optiques intrinsèques des particules qui correspondent aux phénomènes de diffusion lumineuse liés aux dimensions de la particule, à leur structure interne, ou à l’auto fluorescence de certaines cellules comme les végétaux, le phytoplancton...
-aux propriétés optiques induites de fluorescence obtenues par des marquages spécifiques de structures ou de fonctions cellulaires.
Ces signaux séparés par des filtres optiques sont collectés par des photomultiplicateurs, amplifiés, numérisés, traités et stockés par un ordinateur.
Ce procédé d’analyse individuelle (cellule par cellule) est multiparamètrique et peut s’effectuer à la vitesse de plusieurs milliers d’événements par seconde. L’ordinateur calcule les données statistiques associées aux distributions des paramètres mesuré et les représente sous la forme d’histogrammes (1 paramètre) ou de cytogrammes (2 paramètres) sur une ou plusieurs populations dont les propriétés cellulaires sont ainsi évaluées.
La fonction tri des cytomètres en flux les plus évolués permet de trier physiquement plusieurs populations cellulaires définies par leurs propriétés optiques.
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